漂亮的 WB 條帶就像課題組的好男人，都說有但沒人見過，被傷害的碩博生繃不住了......

WB，一個科研界的「神級」實驗，擁有着非常獨特的品質：神秘、強大、有影響力。

神秘：漂亮的 WB 條帶就像鬼，人人都說有但是從來沒人在實驗室裡見過。

強大：很難被實驗技巧所幹預，身經百戰的科研老司機也會遭遇 WB 的背刺！

有影響力：影響範圍極其廣泛，從研一到博後，甚至導師面對之，也會望而卻步。

一次 WB 至少 36 個小時，曝光條帶「開盲盒」的時候，映入眼簾的往往是：髒背景、信號弱、大氣泡、歪條帶，甚至沒條帶.......

學霸君爲大家整理了 6 個異常條帶的原因以及修正策略。

文末還附上了科研人 WB 專項訓練，一週跟練，讓你的 WB 得到質的提升。

髒髒帶 —— 高背景條帶

來源：丁香實驗

高背景是 WB 中最常見的問題之一，它會嚴重干擾條帶的辨識。看着醜、ImageJ 也分析不出來，基本等於無用條帶。拿到它也就證明你浪費了寶貴的 36 小時。

可能原因 & 對策：

洗滌可能不充分：使用含 Tween-20 的 PBST 作爲洗滌液，增加洗滌次數至 3-5 次，每次 5 分鐘。

封閉不充分：嘗試使用 BSA 或其他低內毒素封閉液替代牛奶，減少非特異性結合。

抗體本身問題：實驗前對一抗進行預吸附處理，去除可能的交叉反應成分。* 選用純化抗原、過表達裂解物或同源蛋白填充柱/管，加入一抗孵育後離心或過濾，棄去溶液保留抗體，以此減少 WB 非特異性結合。

彎彎帶 —— 偏移條帶

來源：丁香實驗

有時，曝光後會突然出現凹凸不平或者偏移的條帶。這些條帶位置不準確的情況，常見於科研小白（或者讓小白幫你配膠的科研大佬）因爲這些條帶很可能是膠引起的。

可能原因 & 對策：

凝膠聚合不均勻：灌膠時候儘量混合均勻，動作輕緩。（見文末專項訓練）

分離膠凝固問題：凝固時可用 1 mL 無水乙醇覆蓋分離膠液麪，阻斷空氣，分隔線會更加平直，也會減少 「微笑」 或 「倒微笑」 等彎彎條帶的出現。

膠板底部有氣泡：這些氣泡會影響電泳效果，開始電泳前應傾斜電泳裝置，趕走氣泡。

淡淡帶 —— 很淡很淡的條帶

來源：丁香實驗

這種雜交信號很弱的條帶往往出自老司機之手，並非操作問題，而是蛋白量、抗體量、轉膜時間估算出現了問題。（不提前計算好時間、細節而盲目自信導致的）。

很可惜！這類條帶雖然能看出趨勢，但是對於數據統計和文章發表來說依舊不夠標準。

可能原因 & 對策：

蛋白量太少：可以適當增加蛋白上樣量（通常一孔 20-100μg 總蛋白）

抗體效價太低：可以適當加大抗體濃度，或者更換其他抗體過度漂洗膜：這也可能會導致信號變弱、條帶太淺;

轉移到膜上的蛋白太少：當蛋白分子量 <10 KD 時，可減少轉膜時間、使用小孔徑的膜或配置厚度適當的凝膠。

粘連帶 —— 連在一起的條帶

來源：丁香實驗

條帶連在一起，通常意味着實驗中存在一些「技術問題」，這樣的條帶降低了分辨率，不同孔的蛋白條帶無法清晰區分，基本無法統計。

以下是可能的原因及相應的對策：

可能原因 & 對策：

上樣量過大：減少上樣量至推薦範圍（通常 20-100μg 總蛋白），可先嚐試減半上樣量。

一抗孵育時間過長：縮短一抗孵育時間，一般 4°C 過夜較爲合適，或按抗體說明書推薦時間執行。

加樣孔殘留膠：拔梳子後徹底沖洗並吸乾加樣孔，避免膠殘留導致擴散。

上樣速度慢導致擴散：快速且均勻地上樣，減少樣品在孔口的停留時間。

APS（過硫酸銨）長時間存放：確保每次使用新配製的 APS，避免因降解導致的問題。

裝板不緊密：確保電泳膠與膜、膜與濾紙間裝配緊密，減少漏電。

點點帶 —— 出現黑點的模糊條帶

來源：丁香實驗

這類條帶的出現，可能與多種操作問題相關，包括抗體、轉膜、操作污染，需要一一排查。

可能原因 & 對策：

抗體沉澱：抗體使用前充分混勻並短暫離心，避免抗體顆粒形成。ECL 試劑不均：確保 ECL 試劑新鮮並均勻塗抹，可輕輕搖晃混合後再使用。

膜過於乾燥：在操作過程中保持膜溼潤，避免膜在空氣中暴露過久。抗體稀釋液問題：使用無菌、無顆粒的 PBS 或 TBST 稀釋抗體，確保溶液乾淨。

膜質量問題：更換高質量 PVDF 或 NC 膜，避免使用劣質或破損的膜。

操作污染：實驗全程戴手套，使用無菌操作，避免灰塵和異物落入。

泡泡帶 —— 出現氣泡、雜質的條帶

來源：丁香實驗

很多人認爲泡泡帶一定是轉膜時產生氣泡，但其實還可能有以下問題。

可能原因 & 對策：

轉膜時產生氣泡：轉膜前用緩衝液預溼膜，轉膜時緩慢放下，用吸水紙輕壓排出氣泡。

電泳膠不平整：確保凝膠和電泳槽底部貼合緊密，使用夾子固定，防止氣泡生成。

樣品含有顆粒：使用超聲波破碎或過濾樣品，去除顆粒物，確保樣品純淨。

封閉不充分：適當延長封閉時間，使用足夠的封閉液量，確保膜全面覆蓋。

沒有帶 —— 我條帶呢？

來源：丁香實驗

最後，很多同學可能會經歷沒有條帶的 WB 條帶，遇到這種問題可先別想着重新做實驗，把條帶丟掉，其實你的條帶可能還有救。

可能原因 & 對策：

抗體失效：驗證抗體活性，更換新批次抗體再試一次，如仍沒有條帶可能是以下問題。

電泳或轉膜失敗：檢查電泳緩衝液、凝膠濃度和轉膜時間，確保電泳和轉膜過程正常。

樣品降解：使用蛋白酶抑制劑，快速冷凍樣品，防止蛋白在提取和處理過程中降解。

膜過度清洗：減少洗滌次數或縮短每次洗滌時間，避免過度清洗導致信號減弱。

以上就是 6 個異常條帶的原因以及修正策略，掌握了上述策略，下一步就是將其轉化爲實際操作的肌肉記憶啦。

學霸君爲你設計了更具挑戰性和實用性的專項練習，快收藏本文，一起進步吧！

最後，請查收 WB 人一週專項訓練，跟着學霸君練起來！

週一：配膠 *3 板（8%、10%、12%），鍛鍊手部穩定性

週二：挑出最佳膠板跑膠 *1 次，計算電壓並記錄時間

週三：自己轉膜 *1 次；臨摹師兄師姐轉膜 *1 次

週四：1 分鐘速度疊船 *10 只（各種尺寸大小）

週五：休息日，檢查實驗筆記並覆盤。

相信我，連續堅持 3 周下來，你的 WB 也可以有質的提升。