Cell Discov：周斌團隊合作開發鄰近細胞遺傳操作新技術
來源：國科大杭州高等研究院
繼登上國際最權威學術期刊之一 Cell 後，近日，國科大杭州高等研究院周斌教授工作室合作研究成果「Intercellular genetic tracing by alternative synthetic Notch signaling」又在國際學術期刊 Cell Discovery 在線發表！該研究結合合成生物學技術與遺傳學技術，構建了體內鄰近細胞遺傳標記新技術，並揭示在胚胎髮育及器官生成過程中存在不同細胞類型之間的細胞通訊現象。該工作爲人們瞭解早期器官發育及對臨牀早期發育異常疾病的診治提供了研究基礎，也爲開展體內鄰近細胞研究提供了重要技術支持。
細胞與細胞交流參與維持生物體正常功能，因此，開發用於研究細胞與細胞交流的遺傳操作新技術，對於更好了解體內複雜生物學事件的微環境調控及其分子機制具有重要意義。近期，周斌團隊基於 Notch 信號通路工作原理，在體內構建人工合成的 Notch 信號通路，稱爲 Synthetic Notch（synNotch），利用 synNotch 首次在哺乳動物體內創建了鄰近細胞遺傳示蹤技術（genetic tracing of cell-cell contact，gTCCC）。
該技術原理是將 Notch 配體的胞外段替換爲 synNotch 配體 mGFP；將 Notch 受體的胞外段替換爲 synNotch 受體 anti-GFP，而胞內段替換爲 tTA，跨膜域保持不變；再結合 tetO-on 與 Cre-loxP 系統，當表達 synNotch 受體的細胞與表達 synNotch 配體的細胞發生接觸時，就可以實現對受體細胞進行遺傳標記及操作（Science，2022；Dev Cell，2023）。
在本項研究中，研究人員開發出多種基於 synNotch 技術的鄰近細胞標記新技術。首先根據 mCD19 和 anti-CD19 構建 synNotch 技術用於鄰近細胞標記，簡稱爲 gTCCC2。研究人員構建了兩種誘導型 mCD19 配體工具小鼠：R26-L-mCD19 和 R26-R-mCD19，以及一種 anti-CD19 內皮細胞受體工具小鼠：Cdh5-aCD19NtTA-tdT。研究人員以心肌細胞與內皮細胞接觸爲例對 gTCCC2 技術進行鑑定。
研究人員首先獲得 Tnni3-Dre;R26-R-mCD19;Cdh5-aCD19NtTA-tdT;tet-Cre 四基因型小鼠檢測心肌細胞是否與內皮細胞發生直接接觸。在四基因型工具鼠中，心肌細胞表達 mCD19，與內皮細胞接觸時 mCD19 會識別內皮細胞膜表面的 anti-mCD19，從而釋放 tTA 入核啓動 tet-Cre 表達從而介導 Cre-loxP 重組，將內皮細胞（受體細胞）標記爲 tdT+。通過對新生期小鼠進行鑑定，研究人員成功檢測到心臟內皮細胞被高效率標記，以上說明 gTCCC2 技術構建成功。
類似的，研究人員另一方面利用 mCherry 和 anti-mCherry 構建第三種鄰近細胞標記技術 gTCCC3。通過免疫熒光染色，研究人員發現成纖維細胞與內皮細胞鄰近分佈。爲驗證這兩種細胞類型是否發生細胞接觸交流，研究人員構建了 Pdgfra-mCherry 小鼠可使成纖維細胞表達 synNotch 配體 mCherry，同時構建了兩種版本表達 anti-mCherry 的內皮細胞工具小鼠，Cdh5-amCh2NtTA-BFP 和 Cdh5-amCh4NtTA-BFP。
理論上，在 Pdgfra-mCherry;Cdh5-amChNtTA-BFP;tet-Cre 小鼠中，當內皮細胞與成纖維細胞發生接觸時，內皮細胞被標記爲 BFP+。通過體內驗證，研究人員檢測到新生期小鼠多種器官中內皮細胞被標記，這說明在胚胎髮育中，成纖維細胞與內皮細胞會發生直接接觸交流從而參與器官生成。另外，研究人員也在體內成功驗證了三種基於 synNotch 的鄰近標記技術：gTCCC，gTCCC2，gTCCC3 不會發生交叉識別，可以正交使用。
綜上，研究人員基於 synNotch 成功構建出兩種體內細胞鄰近遺傳操作技術，結合 Cre-loxP 系統可對接觸細胞進行特異性遺傳學操作，以上三種 gTCCC 技術爲進行體內複雜的細胞與細胞交流研究提供了重要的遺傳學技術支持。
杭高院爲該工作的第一完成單位。杭高院周斌課題組副研究員劉擴與中國科學院分子細胞科學卓越創新中心張少華博士爲該論文共同第一作者。復旦大學附屬中山醫院王利新教授與杭高院周斌研究員爲該論文共同通訊作者。該研究得到分子細胞卓越中心動物平臺和細胞平臺的大力支持。該工作得到基金委、科技部、新基石科學基金會、杭高院基金等支持。
圖注：鄰近細胞遺傳操作技術 gTCCC2 和 gTCCC3
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41421-024-00721-9
本文及圖片來源於國科大杭州高等研究院，作者轉載