全球首例複製猴在大陸誕生之秘！孫強親曝過程

全球首對體細胞克隆猴「中中」（左）和「華華」 （右）。（圖：中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心）

2017年年底，一個世界級成果：全球首例體細胞克隆（複製）猴，在中國大陸誕生。相關論文隨後於2018年1月25日在國際學術期刊《細胞》（Cell）上在線發表。這一消息當時就引爆了整個學術圈和科研界。

此前，全球科學家經過數十年的努力，但一直未能攻克非人靈長類動物體細胞克隆的難題。直到兩隻體細胞克隆猴「中中」、「華華」誕生在中國大陸科學家手中。這一技術的突破，意味着人類可以藉助克隆猴技術，揭開更多生命科學的奧秘，比如靈長類的發育、大腦以及多種疾病相關難題。

但即便到了今天，克隆猴技術依然存在瓶頸，成功率依舊不高。近日，中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心非人靈長類研究平臺研究員孫強接受了澎湃新聞和《世界科學》記者的專訪。

「我們做克隆猴，目的是更好地構建非人靈長類模式動物。」孫強說，「模式動物」的「模式」是什麼？就是像用一個模子刻出來的。

爲什麼需要克隆猴？

在克隆猴誕生前，猴子也被用於轉基因或藥物測試等研究。但這些猴子都是由受精卵發育來的。

「但它有一個問題就是，它們的基因型是不同的，各個猴子之間的遺傳背景不同。」孫強表示。

「再舉個例子，比如說用考試去篩選一羣學生，我們要給這些學生同樣的考卷，對不對？否則100個人參加考試，有100張不同的考卷，你怎麼評價誰的水平高，誰的水平低？我們篩藥也是一樣。你這個藥好不好，你得用同樣的「試卷」評價。這樣才能減少樣本間的誤差。這時候，藥就是這些「考生」，猴子就是這些「考卷」。篩藥時使用的猴模型，比如說基因編輯和轉基因的猴，如果它們的基因型有不同，致病基因可能在表達水平上有差異，遺傳背景有影響，那麼就把這個問題複雜化了。克隆技術正好可以解決這一難題，讓它們遺傳背景又一致，基因型又一致。這樣就能夠讓它真正變成模式動物。所謂模式是什麼？就是用一個模子刻出來的。」

克隆猴提供了幾乎完美的模型。猴是靈長類，是生命演化中最接近人的動物。

「比如，如果我有一批A基因突變的猴子，其他所有背景都一樣，只是A基因有差異，如果跟對照相比，一個藥物能夠緩解A基因突變導致的症狀，那麼就可以確認這個藥是對的。」孫強說。

除了測試藥物，基於這一幾乎完美的動物模型，人們可以進行新藥的研發，以及探索生命科學更多未知的疆域。

其實，「克隆」無處不在。植物的無性繁殖，比如插條、嫁接、落葉生根等，都是「克隆」。

人類也在很早就開始嘗試克隆各種動物。但非人靈長類動物，比如猴子的克隆始終是個難題。

早在20世紀初，德國動物學家、實驗胚胎學先驅漢斯·斯佩曼（Hans Spemann）已經使用胚胎分裂技術克隆出了蠑螈。

胚胎分割技術作爲早期探索階段的技術，當然是不完美的，它的效率很低，因而沒有成爲動物克隆領域的主要方向。孫強表示，「你可能在二細胞期或四細胞期分割，你最多也就分離出4個細胞。假如全部都變成個體，最多也就變成4個個體。但實際上，四細胞期有時候也就出生存活一個或者兩個，所以說目前胚胎級克隆的克隆數有限。而體細胞克隆，理論上是無限的。」

所以，現代的動物克隆技術的主流是「核移植」，尤其是體細胞核移植——給卵母細胞（卵細胞）換一個細胞核。因爲胚胎細胞在數量上的侷限性，體細胞是更好的核來源。結果就是，一個細胞核，對應着克隆後代的一個小生命。

1928年，斯佩曼嘗試將蠑螈胚胎細胞核轉移到卵細胞中，雖然最終沒有克隆成功，卻是「移核」的首次實踐。

1962年，英國牛津大學的科學家約翰·戈登（John Gurdon）將非洲爪蟾腸上皮細胞的細胞核移植到蛙卵細胞裡，並培養出蝌蚪。其實驗成功率只有2％。

1996年，克隆羊多利誕生。277次核移植，只產生29個胚胎，最後有且只有多利幸運地出生了，這個成功率比非洲爪蟾的2％還低。但多利的誕生，打破了「哺乳動物體細胞無法分化」的成見。

隨後，豬、牛、狗等動物的體細胞核移植克隆都被實現。

但克隆猴一直「胎死腹中」。

克隆猴不是僅僅爲了克隆猴。克隆猴誕生之初，研究團隊負責人蒲慕明院士說：製備克隆猴不是爲了獵奇，更不是爲了克隆人，而是爲了建立非人靈長類疾病動物模型，爲研究人類疾病機制和藥物研發帶來希望。

愚公「移核」與克隆猴的瓶頸

在體外人工構建一個生命體，何其難？生命的繁衍過程太複雜了。

「挑戰太多了！」孫強說，「不用說培養一隻猴子，就是從胚胎，不依賴任何母體，直接培養出一隻老鼠，那都是非常震撼的事情，意味着（哺乳動物）生命可以在體外培育了，那是真正的試管了。」

他表示，「目前，早期胚胎的所有發育還沒完全搞清楚，子宮是怎麼保證胎兒營養的，器官在子宮內是怎麼分化的，什麼誘導了器官的對稱發育，沒有回答的問題太多了。」「離開子宮還做不到，你怎麼模擬一個子宮的環境？早產兒，畢竟在母體裡懷孕到150天或者更長時間，接近出生，各個器官都發育完成了，但是要真正變成從一個受精卵一個細胞開始完全培養、發育長出來很難。如果那個能做出來，遠比克隆要震撼得多！」

所以，現在要克隆猴，還是要「借腹」：依靠卵母細胞，構建一個重組細胞，激活，移植到代孕猴的子宮內，然後待產。

孫強介紹，2003年，美國匹茲堡大學教授傑拉爾德·沙滕（Gerald Schatten）依靠美國俄勒岡靈長類中心，曾經一次性做了700多個卵，然後移植到30多隻猴子體內，最後都沒生，他當時很失望。俄勒岡靈長類中心的另一位教授舒克拉特·米塔利波夫(Shoukhrat Mitalipov)覺得這可能是技術問題。2007年，他接受一個雜誌的採訪，說他已經用了15000枚卵來做克隆猴。到2010年的時候，他發了一篇論文，就是把克隆胚胎移到10只猴子體內，但是隻有1只懷孕，而且懷孕到81天，這個猴子流產了。

「我們總共用了接近5年時間去解決這些問題，前邊都是失敗、失敗、失敗，最大的失敗出現在2017年的8月。」「8月的時候，我們就得到了兩隻克隆猴，一隻在140多天的時候生出來，活了三個小時，沒有肺呼吸，死掉了；另一隻活了30個小時也死掉了。那個時候我們的失望達到了極點，就像買彩票，彩票中獎號碼是10個，第1個號碼到第9個號碼都是對的，然後到第10個號碼突然錯了。」

他們從失敗中走出來，2017年年底，終於成功做出了全球首例體細胞克隆猴。

孫強介紹，「實際上，因爲體細胞很小。猴子的卵母細胞直徑110微米，很大，體細胞直徑大概就十幾個微米。我們沒有取核，它帶的細胞器和線粒體也很少。我們是直接把整個體細胞融合進去了。我們檢測過，『華華』細胞中來自供體猴體細胞的線粒體接近20％，『中中』的大約不到3％。」

「現在的問題是，其實克隆的效率還是很低的。猴子體細胞的表觀重建的機制，以及早期胚胎的表觀遺傳學變化還不清楚。我覺得，最主要（工作）的首先是，把猴子的表觀遺傳學機制解析清楚。在此基礎上，真正提升體細胞克隆的效率，希望能把現在大概3％左右的水平，提升到10％或以上。」

孫強說，「在2024年年初，我們發了一篇文章，在克隆恆河猴時，我們解決了胎盤的發育問題，通過滋養層細胞置換，把克隆胚胎移植出生效率從2％提升到9％左右，提升到了四倍多。」

孫強表示，克隆不是一個自然發育的過程，要打破很多障礙。通過這個克隆過程中，人們可以瞭解胚胎早期發育的，尤其表觀遺傳學層面的生物學機制，這也是對生命的認識。

目前，孫強團隊正在用多組學和測序的方法來分析，細胞基礎表觀的變化是什麼樣的，克隆時什麼樣，來觀察各種調控過程的振盪。

科研三階段：試管猴、轉基因猴、克隆猴

「有人跟我聯繫，說他養的寵物狗不行了，能不能把它克隆出來。國內有公司在做。我做的是克隆猴，不會做克隆狗。」孫強說。

在一次演講中，孫強提到他研究歷程中的三個階段：試管猴、轉基因猴、克隆猴

他說，在雲南省的西雙版納州瀾滄江畔的一座山上，他工作了4年，一直待到2008年。

那是一個973國家重點研發項目，他接手的時候，項目已經執行了一半。因爲2001年轉基因猴技術體系已經建立了，所以項目的目標是希望做出轉基因猴。他是半途去的，目標是至少要做出試管猴，如果能做出轉基因猴更好。

他記得非常清楚，2007年立春的2月4日當天，他們就做出了中國大陸第一隻試管猴，之後又做了十幾只猴子，但是很遺憾，沒有一隻是轉基因陽性的。項目結束以後，由於沒有資金的支持，他從山上撤了回來。

回來以後，在上海待了半年多。很幸運，一個機會出現了。中國科學院神經所的蒲慕明先生找到他，讓他繼續做猴子。

這次是蘇州太湖的西山島，上面有一個很大的猴場，1萬多隻猴子，他就到島上去陪猴子了。

在孫強的講述裡，工作人員要做的一件事情是要看猴子的月經。島上的實驗室大概有幾百只猴子，每天都要看猴子的月經。每次猴子「超排卵」都要打針，從月經來的第一天開始，一般要打12天，一天打2針。

孫強介紹，小白鼠連續20代近交，得到近交系，遺傳背景是一致的。小鼠的繁殖週期大概是半年，連續20代也就頂多10年時間，這件事在上個世紀初就做完了。但猴子的繁殖週期、性成熟時間、傳代時間要5年，做20代就要100年，「沒人能做得成」。

這就是人們爲什麼需要克隆猴：要跳過近交，要縮短這100年。

在世界首個體細胞克隆猴成果新聞發佈會上的報告中，孫強表示，體細胞克隆總結下來有四個節點：構建胚胎、激活胚胎、啓動核基因組、着牀後發育。除了最後一個節點無法控制，前三個節點都可以干預。只不過，每一個節點都是一座「大山」。

起初，團隊裡其他成員都是獸醫，包括取卵在內的大部分精密實驗操作都由孫強一人承擔。

據中國科學報報導，即使在2010年國慶假期，孫強在雨夜騎車出車禍、鎖骨骨折，他也忍着劇痛花十天做完原定的取卵實驗才住院手術。絕大多數時候，大多數目標都不值得以健康爲代價的投入，但在該項卓絕的研究面前，孫強認爲他必須這麼做。

幸運的是，研究生劉真在2010年加入孫強團隊，次年開始在島上生活，並很快成長爲骨幹。

據媒體公開報導，劉真花了兩年時間練習並優化構建胚胎的流程。他剛開始是在小鼠卵母細胞上練習，每天練習8到10個小時，差不多連續練習了三四個月。後來，他又轉到難度更大的猴子細胞上練習——眼睛看着顯微鏡，兩隻手操作，腳也有操縱任務。手腳並用練到2014年底，劉真的相關實驗操作技術爐火純青，去一個細胞核平均只需要10秒鐘，而注入同樣用時甚短。目前，除了劉真，中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心非人靈長類研究平臺已經擁有一支能夠熟練進行體細胞核移植的隊伍。

孫強表示，只有精湛的技術，才能保證對卵母細胞損傷最小。

爲了提高激活胚胎的成功率，孫強團隊還嘗試了多種激活條件，一開始使用只有13％囊胚率的離子黴素＋6-DMAP，後來使用組蛋白乙酰化酶抑制劑處理，囊胚率提高到16％。借鑑一篇2014年發表的論文中的研究方法，他們用H3K9me3去甲基化酶Kdm4處理，囊胚率提高到45％。

孫強團隊還嘗試了不同來源的體細胞來構建胚胎。最後，他們發現成纖維細胞是最好的選擇。也正是用成纖維細胞核，他們成功克隆出了「中中」和「華華」。

孫強表示，「追求真理，保持好奇心。」克隆猴「中中」「華華」只是個起點，他希望，在這個基礎上能做出更好的非人靈長類模式動物。「我還要感謝一下我的家人，因爲這些年，跟猴子在一起的時間，比跟他們在一起的時間都多。」